PK-15细胞低血清培养

北京清大天一生物技术有限公司

一、 PK-15细胞的特点及用途

1.         PK-15系猪肾细胞（pig kidney），体外培养呈上皮样贴壁型细胞；

2.         该细胞对多种病毒比较敏感，如猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（CSFV）等，可应用于猪圆环病毒疫苗、猪细小病毒疫苗、猪瘟病毒疫苗等的制备。

3.         目前培养PK-15细胞生产疫苗的主要是转瓶工艺，培养基为基础培养基DMEM、199或MEM+10%小牛血清。

4.         该细胞较易适应低血清培养，并有不同的克隆，血清使用量可降低至3-5%。

二、PK-15细胞低血清培养

1、细胞形态

在方瓶中使用低血清培养基（MD611）逐代降低血清使用量，进行细胞的低血清驯化适应，在低血清培养状态下，细胞具有清晰的轮廓、立体感较强，细胞更致密，与原培养液的细胞形态无差异。

PK-15细胞以一定接种密度（3-4×10⁴个/cm²）接种方瓶进行连续传代，3d左右细胞可形成单层或致密单层，需及时传代。如下图所示，使用低血清培养基+5%NBS培养的细胞与DMEM+10%NBS培养的增殖速率基本无差别，细胞3d可增殖6-7倍，细胞数可达2×10⁷个/T75。

三、低血清培养PK-15细胞的探讨

1.         细胞在改变培养环境时，如改换培养基、血清，包括血清批号、血清厂家、血清浓度等，细胞的培养情况可能会与先前培养的经验有所差异，此时应注意细胞的传代比例、分种时间等，应根据细胞的生长情况进行调节。比如细胞在改变初期pH变化可能较快，应及时对细胞进行换液培养，PK-15细胞培养液pH一般不应低于6.8；

2.         低血清培养基营养成分丰富，PK-15细胞代谢旺盛，因此在使用低血清培养基时需按照产品说明加入标示量的碳酸氢钠以维持适当的pH及渗透压，有利于细胞的生长、增殖；

3.         PK-15细胞在低血清培养基中比较容易适应培养，血清量可间接或直接进行降低。本实验室做过10%、7%、5%血清的逐代降低，细胞按照4×10⁴/cm²密度接种，3d进行传代，细胞可良好适应。

四、MD611低血清培养基的配制方法

MD611培养基不同于传统的培养基，培养基的正确配制和使用方法影响细胞的培养效果，应严格按使用说明书配制使用。以50L/包规格低血清培养基为例，应按以下程序配制培养基。

1.       打开培养基包装，将培养基全部倒入一容器中。

2.       用少量冷却注射用水（20℃～30℃）涮洗袋内残留培养基，倒入容器内。

3.       向容器中加入约40L冷却注射用水（20℃～30℃），搅拌至培养基完全溶解。

4.       按使用说明书标示量加入114.5克碳酸氢钠，搅拌至完全溶解，补加冷却注射用水（20℃～30℃）至50L，充分混合，用pH计检测，溶液pH应为7.2～7.4。

5.       按使用量加入血清和抗生素，混合均匀，用0.22μm滤膜正压过滤除菌。

6.       除菌后培养基，置2℃～8℃避光保存。

五、MD611低血清培养基一些注意事项

1.       不可配制成浓缩液储存使用。

2.       不可用高压湿热法进行灭菌。

3.       不可冷冻储存，再溶解使用。

4.       不可常温储存，2～8℃储存。

5.       该培养基中已含谷氨酰胺，由于谷氨酰胺不稳定，易分解，产生对细胞敏感的毒性物质，故加入血清的完全培养液应尽快使用完毕。

6.       该培养基中所含指示剂酚红的量是常规量的一半，故从外观上看所配溶液颜色较浅，精确判定pH时，建议用pH计测定pH。